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제목 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응 시스템 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적 RNA 검출 방법 등록일 2020.03.09 14:43
  • 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응 시스템 기반 등온 핵산 증폭 기술을
    이용한 표적 RNA 검출 방법

  • 신용범(바이오나노헬스가드연구단)
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성과개요

연구기관/연구책임자 한국과학기술원 / 박현규 교수
과제명 On-site 보급형 분자진단 플랫폼 개발
성과개요 Reverse transcription-PCR (RT-PCR)은 높은 정확도 및 민감도로 인해 표적 RNA 검출의 표준 기술로서 사용된다. 하지만, RT-PCR 기술을 구현하기 위해서는 핵산 증폭 반응을 위한 정교한 온도 조절이 요구되며, 이는 진단기기의 소형화를 방해하는 요인으로 작용한다. 따라서, RT-PCR 기술은 진단 설비가 갖추어진 대형 병원 또는 전문 진단 센터 등의 시설에서만 제한적으로 사용될 수 있다는 단점이 있다.
상기 단점을 해결 가능한 표적 RNA 검출 기술로서 nucleic acid sequence-based amplification (이하 NASBA) 기술이 개발되었다. NASBA 기술은 등온 조건 (41 ⁰C)에서 표적 RNA의 증폭 반응이 구현되는 등온 핵산 증폭 기술이다. 하지만, 본 기술의 경우, RNA 증폭 반응이 오직 T7 RNA 중합효소의 전사 반응에만 의존한다. 따라서, 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 생성되는 반응의 효율이 낮을 경우, RNA 증폭 반응 효율이 저하될 수 있으며, 이는 착오 신호 (false signal)를 발생시키는 요인으로 작용할 수 있다.
본 연구에서는 기존 NASBA 기술의 단점을 해결하기 위해, 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응과 T7 RNA 중합효소 반응을 융합함으로써, 기존 NASBA 기술 대비 높은 증폭 효율을 가지는 신개념 등온 핵산 증폭 반응 (Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification (NESBA))을 구현하였다.

▲ Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification

성과내용

주요내용

  • - 본 NESBA 기술에서는 기존 NASBA 기술과 달리 절단효소 인식 염기서열이 수식된 프라이머가 반응에 참여함으로써, T7 프로모터 및 절단효소 인식 염기서열이 수식된 이중가닥 DNA가 생성된다. 절단효소 인식 염기서열이 존재할 경우, 절단효소에 의해 이중가닥 DNA의 단일가닥이 절단된다. 상기 절단 반응에 의해 생성된 짧은 DNA 가닥은 새로운 DNA 합성을 위한 프라이머로서 사용되어, DNA 중합효소에 의해 새로운 DNA 합성 반응이 진행된다. 본 반응에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 합성 반응 중 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지고 있다.

    따라서, 상기 생성된 짧은 DNA 가닥을 프라이머로서 사용하여 새로운 DNA가 합성될 경우, 주형과 미리 결합되어있는 DNA가 떨어져 나오게 된다. 주형으로부터 떨어져 나온 DNA는 반응에 참여하지 않은 프라이머와 결합하여 새로운 이중가닥 DNA를 생성할 수 있다.

    이와 같이, 절단효소 및 DNA 중합효소 활성을 기반으로 한 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응을 구현함으로써, T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA를 지수함수적으로 증폭시키고, 결과적으로, 기존 NASBA 반응 대비 향상된 증폭 효율을 보이는 신개념 등온 핵산 증폭 반응 (NESBA)을 개발한다.

    혁신성

    기존 지식/기술 대비 성과의 차별성 :
  • - 본 연구에서 개발된 NESBA 기술은 기존 PCR 기술 대비 진단기기의 소형화 측면에서 유리할 뿐만 아니라, 종래의 등온 핵산 증폭 기술 (NASBA) 대비 높은 핵산 증폭 효율을 보인다.

    우수성

    세계최고 수준의 성과와 비교 :
  • - 본 연구에서 개발된 NESBA 기술은 현재 글로벌 분자진단 시장에서 가장 우수한 검출 성능을 보이는 Alere社의 등온 핵산 증폭 기술 (nicking enzyme amplification reaction (NEAR))과 필적할 만한 표적 RNA 검출 성능을 보인다.

    주요 기능/사양

    주요기능/사양 내용  
    기술 ○ 다중분석능력: 동시 9종 이상
    ○ 민감도: 시판 중인 골드기반 스트립기반 진단키트에 비해 우수
     

기대효과 및 향후계획

학술적/기술적 기대효과 단일 샘플과 한 번의 테스트로 다중진단이 가능하기 때문에 현장에서 heterogeneous 임상샘플의 정확한 진단이 가능할 것으로 기대함.
경제적 기대효과 사용이 매우 간편하고 검사시간이 매우 짧으며 고가의 검사장비를 필요로 하지 않아 검사비용의 절감효과가 기대되며, 현재 감염성 질병진단 시장에서 감도가 향상되고 다중진단이 가능한 면역진단 래피드 키트개발 및 제작으로 시장성 확보 기대됨.
기타 기대효과 기존 래피드 키트와 동일한 방식으로 작동 가능하여 시장 진입 가능성이 높을 것으로 기대됨.
향후 계획 소량의 단일 샘플을 이용하여 9종 이상의 바이오마커를 검출할 수 있는 다중진단 미세유체칩으로서, 지카, 뎅기, 치쿤쿠니아, 마야로, 황열 등 열대성 감염병을 동시에 신속, 현장 진단과 말라리아, 심근경색 등과 같은 다양한 마커를 하나의 칩 상에서 다중 진단가능하며, 다양한 질병 진단에 응용할 계획임.

성과근거자료

주요연구실적

  • SCI 국외 학술지 게재 : Advanced Materials, 29(31), 2017(IF: 19.791)
  • 국내특허출원 1건(10-2018-0036512)
  • 기술이전 1건((주)라디안큐바이오, 기술료 7,000만원)
  • 국내언론보도(아시아경제 외 12건)
  • 용역과제 실시((주)라디안큐바이오, 5,000만원/년)

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